- El método 454 puede secuenciar fragmentos de ADN? equivalente a hasta mil millones Bases?, en un solo día (eso es 1/3 del humano genoma?).
- Es mucho más barato y más rápido que los métodos utilizados para secuenciar el ADN en el Proyecto Genoma Humano?.
- Sin embargo, la plataforma no está exenta de debilidades. Tiene dificultades para distinguir el número de bases en una serie de bases idénticas (como AAAA).
Una máquina de secuenciación 454.
Crédito de la imagen: Genome Research Limited
¿Cómo funciona la secuenciación de ADN 454?
- El proceso comienza con una muestra de ADN bicatenario.
- El ADN se divide en fragmentos de alrededor de 400 a 600 pares de bases? Uso de la restricción enzimas? que ‘cortan’ el ADN en puntos específicos.
- Secuencias cortas de ADN llamadas Adaptadores?, están unidos a los fragmentos de ADN.
- Se agregan pequeñas perlas de resina a la mezcla.
- Las secuencias de ADN en las cuentas son complementario? a secuencias en los adaptadores, permitiendo que los fragmentos de ADN se unan directamente a las cuentas, idealmente un fragmento a cada cuenta.
- Cuando los fragmentos de ADN se unen al ADN en las perlas, los enlaces que unen la doble hebra, se rompen y las hebras se separan, convirtiéndose en ADN monocatenario.
- Los fragmentos de ADN se copian numerosas veces en cada cuenta mediante una reacción conocida como reacción en cadena de la polimerasa (PCR)?. Esto crea millones de copias idénticas de la secuencia de ADN.
- Luego, las perlas se filtran para eliminar las que no se hayan unido a ningún ADN o que contengan más de un tipo de fragmento de ADN.
- Luego, las perlas restantes se colocan en pozos en una placa de secuenciación (una cuenta por pozo) junto con perlas de enzimas que contienen el ADN polimerasa? y cebador? necesario para la reacción de secuenciación
- La enzima polimerasa y el cebador se adhieren a los fragmentos de ADN en las perlas.
- Bases de nucleótidos? se agregan a los pozos en ondas de un tipo de base a la vez: una onda de As, seguida de una onda de Cs, seguida de Gs, seguida de Ts.
- Cuando cada base se incorpora al ADN, se emite luz y esta es grabada por una cámara.
- La intensidad de la luz corresponde al número de nucleótidos del mismo tipo que se han incorporado. Por ejemplo, si hay tres As consecutivos en el fragmento, la cantidad de luz generada sería tres veces mayor que la de una sola A en el fragmento.
- Al trazar este patrón de intensidad de luz en un gráfico, se puede decodificar la secuencia de la pieza original de ADN.