- La electroforesis en gel es una técnica comúnmente utilizada en laboratorios para separar moléculas cargadas como ADN, ARN y proteínas según su tamaño.
- Las moléculas cargadas se mueven a través de un gel cuando se pasa una corriente eléctrica a través de él.
- Se aplica una corriente eléctrica a través del gel para que un extremo del gel tenga una carga positiva y el otro extremo tenga una carga negativa.
- El movimiento de moléculas cargadas se llama migración. Las moléculas migran hacia la carga opuesta. Por lo tanto, una molécula con una carga negativa será tirada hacia el extremo positivo (¡los opuestos se atraen!).
- El gel consiste en una matriz permeable, un poco como un tamiz, a través de la cual las moléculas pueden viajar cuando se pasa una corriente eléctrica a través de ella.
- Las moléculas más pequeñas migran a través del gel más rápidamente y, por lo tanto, viajan más lejos que los fragmentos más grandes que migran más lentamente y, por lo tanto, viajarán una distancia más corta. Como resultado, las moléculas están separadas por tamaño.
Electroforesis en gel y ADN
- La electroforesis le permite distinguir fragmentos de ADN de diferentes longitudes.
- El ADN está cargado negativamente, por lo tanto, cuando se aplica una corriente eléctrica al gel, el ADN migrará hacia el electrodo cargado positivamente.
- Las hebras más cortas de ADN se mueven más rápidamente a través del gel que las hebras más largas, lo que hace que los fragmentos se organicen en orden de tamaño.
- El uso de tintes, fluorescente o radiactivo permite que el ADN en el gel se vea después de que se hayan separado. Aparecerán como bandas en el gel.
- Un marcador de ADN con fragmentos de longitudes conocidas generalmente se pasa a través del gel al mismo tiempo que las muestras.
- Al comparar las bandas de las muestras de ADN con las del marcador de ADN, puede calcular la longitud aproximada de los fragmentos de ADN en las muestras.
¿Cómo se realiza la electroforesis en gel?
Preparación del gel
- Geles de agarosa se utilizan normalmente para visualizar fragmentos de ADN. La concentración de agarosa utilizada para hacer el gel depende del tamaño de los fragmentos de ADN con los que está trabajando.
- Cuanto mayor sea la concentración de agarosa, más densa será la matriz y viceversa. Los fragmentos más pequeños de ADN se separan en concentraciones más altas de agarosa, mientras que las moléculas más grandes requieren una concentración más baja de agarosa.
- Para hacer un gel, el polvo de agarosa se mezcla con un tampón de electroforesis y se calienta a alta temperatura hasta que todo el polvo de agarosa se haya derretido.
- El gel fundido se vierte en una bandeja de fundición de gel y se coloca un «peine» en un extremo para hacer pozos para la muestra a pipetear.
- Una vez que el gel se ha enfriado y solidificado (ahora será opaco en lugar de transparente) se retira el peine.
- Muchas personas ahora usan geles prefabricados.
- Luego, el gel se coloca en un tanque de electroforesis y el tampón de electroforesis se vierte en el tanque hasta que se cubre la superficie del gel. El tampón conduce la corriente eléctrica. El tipo de tampón utilizado depende del tamaño aproximado de los fragmentos de ADN en la muestra.
Preparación del ADN para la electroforesis
- Se añade un colorante a la muestra de ADN antes de la electroforesis para aumentar la viscosidad de la muestra, lo que evitará que salga flotando de los pocillos y para que se pueda ver la migración de la muestra a través del gel.
- Un marcador de ADN (también conocido como estándar de tamaño o escalera de ADN) se carga en el primer pocillo del gel. Los fragmentos en el marcador son de una longitud conocida, por lo que se pueden usar para ayudar a aproximar el tamaño de los fragmentos en las muestras.
- Las muestras de ADN preparadas se pipetean en los pocillos restantes del gel.
- Una vez hecho esto, la tapa se coloca en el tanque de electroforesis asegurándose de que la orientación del gel y los electrodos positivo y negativo sea correcta (queremos que el ADN migre a través del gel hacia el extremo positivo).
Separación de los fragmentos
- La corriente eléctrica se enciende para que el ADN cargado negativamente se mueva a través del gel hacia el lado positivo del gel.
- Las longitudes más cortas de ADN se mueven más rápido que las longitudes más largas, así que muévase más lejos en el tiempo en que se ejecuta la corriente.
- La distancia a la que el ADN ha migrado en el gel se puede juzgar visualmente monitoreando la migración del tinte tampón de carga.
- La corriente eléctrica se deja encendida el tiempo suficiente para garantizar que los fragmentos de ADN se muevan lo suficientemente lejos a través del gel para separarlos, pero no tanto como para que se escurran por el extremo del gel.
Ilustración del equipo de electroforesis de ADN utilizado para separar fragmentos de ADN por tamaño. Un gel se encuentra dentro de un tanque de amortiguador. Las muestras de ADN se colocan en pocillos en un extremo del gel y una corriente eléctrica pasa a través del gel. El ADN cargado negativamente se mueve hacia el electrodo positivo.
Crédito de la imagen: Genome Research Limited
Visualización de los resultados
- Una vez que el ADN ha migrado lo suficiente a través del gel, la corriente eléctrica se apaga y el gel se retira del tanque de electroforesis.
- Para visualizar el ADN, el gel se tiñe con un tinte fluorescente que se une al ADN, y se coloca en un transiluminador ultravioleta que mostrará el ADN teñido como bandas brillantes.
- Alternativamente, el tinte se puede mezclar con el gel antes de verterlo.
- Si el gel ha corrido correctamente, el patrón de bandas del marcador de ADN / tamaño estándar será visible.
- Entonces es posible juzgar el tamaño del ADN en su muestra imaginando una línea horizontal que atraviesa las bandas del marcador de ADN. A continuación, puede estimar el tamaño del ADN en la muestra comparándolos con la banda más cercana en el marcador.
Ilustración que muestra bandas de ADN separadas en un gel. La longitud de los fragmentos de ADN se compara con un marcador que contiene fragmentos de longitud conocida.
Crédito de la imagen: Genome Research Limited