¿Qué es la PCR?
- La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada originalmente en 1983 por el bioquímico estadounidense Kary Mullis. Fue galardonado con el Premio Nobel de Química en 1993 por su trabajo pionero.
- La PCR se utiliza en biología molecular para hacer muchas copias de (amplificar) pequeñas secciones de ADN o un gen.
- Usando PCR es posible generar miles a millones de copias de una sección particular de ADN a partir de una cantidad muy pequeña de ADN.
- La PCR es una herramienta común utilizada en laboratorios de investigación médica y biológica. Se utiliza en las primeras etapas del procesamiento del ADN para secuenciación, para detectar la presencia o ausencia de un gen para ayudar a identificar Patógenos durante la infección y al generar perfiles forenses de ADN a partir de pequeñas muestras de ADN.
¿Cómo funciona la PCR?
- Los principios detrás de cada PCR, cualquiera que sea la muestra de ADN, son los mismos.
- Se requieren cinco «ingredientes» principales para configurar una PCR. Explicaremos exactamente lo que cada uno de estos hace a medida que avanzamos. Estos son:
- la plantilla de ADN que se va a copiar
- cebadores, tramos cortos de ADN que inician la reacción de PCR, diseñados para unirse a cualquier lado de la sección de ADN que desea copiar
- Bases de nucleótidos de ADN (también conocidos como dNTPs). Las bases de ADN (A, C, G y T) son los bloques de construcción del ADN y son necesarias para construir la nueva cadena de ADN.
- Taq polimerasa enzima para agregar las nuevas bases de ADN
- tampón para garantizar las condiciones adecuadas para la reacción.
- La PCR implica un proceso de calentamiento y enfriamiento llamado ciclo térmico que se lleva a cabo mediante máquina.
- Hay tres etapas principales:
- Desnaturalización: cuando el ADN de la plantilla de doble cadena se calienta para separarlo en dos cadenas simples.
- Recocido: cuando se baja la temperatura para permitir que los cebadores de ADN se adhieran al ADN de la plantilla.
- Extensión: cuando la temperatura se eleva y la nueva hebra de ADN es producida por la enzima polimerasa Taq.
- Estas tres etapas se repiten 20-40 veces, duplicando el número de copias de ADN cada vez.
- Una reacción completa de PCR se puede realizar en unas pocas horas, o incluso menos de una hora con ciertas máquinas de alta velocidad.
- Después de que se haya completado la PCR, se puede usar un método llamado electroforesis para verificar la cantidad y el tamaño de los fragmentos de ADN producidos.
Ilustración que muestra los pasos principales en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Crédito de la imagen: Genome Research Limited
¿Qué sucede en cada etapa de la PCR?
Etapa de desnaturalización
- Durante esta etapa, el cóctel que contiene el ADN de la plantilla y todos los demás ingredientes principales se calienta a 94-95 ° C.
- La alta temperatura provoca que el Enlaces de hidrógeno entre las bases en dos hebras de ADN plantilla para romper y las dos hebras para separar.
- Esto da como resultado dos cadenas individuales de ADN, que actuarán como plantillas para la producción de las nuevas hebras de ADN.
- Es importante que la temperatura se mantenga en esta etapa durante el tiempo suficiente para garantizar que las hebras de ADN se hayan separado por completo.
- Esto suele tardar entre 15 y 30 segundos.
Etapa de recocido
- Durante esta etapa, la reacción se enfría a 50-65 ° C. Esto permite que los cebadores se adhieran a una ubicación específica en el ADN de la plantilla monocatenaria mediante enlaces de hidrógeno (la temperatura exacta depende de la temperatura de fusión de los cebadores que está utilizando).
- Los cebadores son hebras simples de ADN o ARN secuencia que son alrededor de 20 a 30 bases de longitud.
- Las imprimaciones están diseñadas para ser complementario en secuencia a secciones cortas de ADN en cada extremo de la secuencia a copiar.
- Los cebadores sirven como punto de partida para la síntesis de ADN. La enzima polimerasa solo puede agregar bases de ADN a una doble cadena de ADN. Solo una vez que el cebador se ha unido, la enzima polimerasa puede unirse y comenzar a hacer la nueva cadena complementaria de ADN a partir de las bases de ADN sueltas.
- Las dos hebras separadas de ADN son complementarias y corren en direcciones opuestas (de un extremo – el extremo 5′ – al otro – el extremo 3′); Como resultado, hay dos imprimaciones: una imprimación directa y una imprimación inversa.
- Este paso suele tardar entre 10 y 30 segundos.
Ampliación de la etapa
- Durante este paso final, el calor se incrementa a 72 ° C para permitir que el nuevo ADN sea producido por una enzima polimerasa especial Taq DNA que agrega bases de ADN.
- La ADN polimerasa Taq es una enzima tomada del gérmenes Thermus aquaticus.
- Esta bacteria normalmente vive en aguas termales, por lo que puede tolerar temperaturas superiores a 80 ° C.
- La ADN polimerasa de la bacteria es muy estable a altas temperaturas, lo que significa que puede soportar las temperaturas necesarias para romper las hebras de ADN en la etapa de desnaturalización de la PCR.
- La ADN polimerasa de la mayoría de los otros organismos no sería capaz de soportar estas altas temperaturas, por ejemplo, la polimerasa humana funciona idealmente a 37 ° C (temperatura corporal).
- 72⁰C es la temperatura óptima para que la polimerasa Taq construya la hebra complementaria. Se adhiere al cebador y luego agrega bases de ADN a la cadena única una por una en la dirección de 5 ‘a 3’.
- El resultado es una nueva hebra de ADN y una molécula de ADN de doble cadena.
- La duración de este paso depende de la longitud de la secuencia de ADN que se amplifica, pero generalmente toma alrededor de un minuto copiar 1,000 bases de ADN (1Kb).
- Estos tres procesos de ciclo térmico se repiten 20-40 veces para producir muchas copias de la secuencia de ADN de interés.
- Los nuevos fragmentos de ADN que se producen durante la PCR también sirven como plantillas a las que la enzima ADN polimerasa puede unirse y comenzar a producir ADN.
- El resultado es una gran cantidad de copias del segmento específico de ADN producidas en un período de tiempo relativamente corto.
Ilustración que muestra cómo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) produce muchas copias de ADN.
Crédito de la imagen: Genome Research Limited