Mamífero grande genomas son particularmente difíciles de clon, secuencian y ensamblan debido a su tamaño y complejidad estructural. Como resultado, la secuenciación clon por clon, aunque confiable y metódica, lleva mucho tiempo. Con la aparición de más barato secuenciación Y programas informáticos más sofisticados, los investigadores se han basado en la secuenciación de la escopeta del genoma completo para abordar genomas más grandes y complejos.
- La secuenciación de escopeta fue utilizada originalmente por Fred Sanger y sus colegas para secuenciar genomas pequeños como los de virus y gérmenes.
- La secuenciación de escopeta del genoma completo evita los largos pasos de mapeo y clonación que hacen que la secuenciación clon por clon sea tan lenta.
- En la secuenciación de la escopeta del genoma completo, todo el genoma se divide en pequeños fragmentos de ADN para secuenciación.
- Estos fragmentos son a menudo de diferentes tamaños, que van desde 2-20 kilobases? (2,000-20,000 pares de bases) a 200-300 kilobases (200.000-300.000 pares de bases).
- Estos fragmentos se secuencian para determinar el orden del ADN. Bases, A, C, G y T.
- Los fragmentos secuenciados se ensamblan juntos mediante programas de computadora que encuentran dónde se superponen los fragmentos.
- Puedes imaginar la secuenciación de escopeta como un poco como triturar múltiples copias de un libro (que en este caso es un genoma), mezclar todos los fragmentos y luego volver a ensamblar el texto original (genoma) encontrando fragmentos con texto que se superponen y volviendo a juntar el libro.
- Este método de secuenciación del genoma fue utilizado por Craig Venter, fundador de la empresa privada Celera Genomics, para secuenciar el genoma humano. Venter quería secuenciar el genoma humano más rápido que el esfuerzo financiado con fondos públicos y sintió que esta era la mejor manera. Para ensamblar la secuencia, Venter utilizó los datos clon por clon disponibles públicamente del Proyecto Genoma Humano.
- Ahora, a medida que las tecnologías están mejorando, la secuenciación de la escopeta del genoma completo se está utilizando para mejorar la precisión de las secuencias del genoma existentes, como el genoma humano de referencia.
- Se utiliza para eliminar errores, rellenar huecos o corregir partes de la secuencia que originalmente se ensamblaron incorrectamente cuando se utilizó la secuenciación clon por clon.
- Como consecuencia, el genoma humano de referencia se mejora constantemente para garantizar que la secuencia del genoma sea del más alto nivel posible.
¿Cuáles son las ventajas de la secuenciación de escopeta?
- Al eliminar las etapas de mapeo, la secuenciación de escopeta del genoma completo es un proceso mucho más rápido que la secuenciación clon por clon.
- La secuenciación de escopeta del genoma completo utiliza una fracción del ADN que necesita la secuenciación clon por clon.
- La secuenciación de escopeta del genoma completo es particularmente eficiente si existe una secuencia de referencia existente. Es mucho más fácil ensamblar la secuencia del genoma alineándola con una secuencia existente Genoma de referencia.
- La secuenciación de escopeta es mucho más rápida y menos costosa que los métodos que requieren un mapa genético.
¿Cuáles son las desventajas de la secuenciación de escopeta?
- Se requieren grandes cantidades de potencia informática y software sofisticado para ensamblar secuencias de escopeta. Para secuenciar el genoma de un mamífero (miles de millones de bases de largo), se necesitan alrededor de 60 millones de lecturas de secuencias de ADN individuales.
- Es más probable que se cometan errores en el ensamblaje porque no se utiliza un mapa genético. Sin embargo, estos errores son generalmente más fáciles de resolver que en otros métodos y se minimizan si se puede utilizar un genoma de referencia.
- La secuenciación de la escopeta del genoma completo solo puede llevarse a cabo realmente si ya se dispone de un genoma de referencia, de lo contrario, el ensamblaje es muy difícil sin un genoma existente al que compararlo.
- La secuenciación de escopeta del genoma completo también puede conducir a errores que deben resolverse mediante otros tipos de secuenciación más laboriosos, como la secuenciación clon por clon.
- Los genomas y secuencias repetitivos pueden ser más difíciles de ensamblar.